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ELISA實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)“花板”現(xiàn)象大探秘 !

更新時(shí)間:2023-09-19    點(diǎn)擊次數(shù):572

  ELISA實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)“花板"現(xiàn)象大探秘 !


  酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) ELISA(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)其原理是抗原或抗體的固相化及抗原抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),由此進(jìn)行定性或定量分析。該實(shí)驗(yàn)因其靈敏度較高,特異性較好,操作較簡(jiǎn)單,可大批量操作而廣泛應(yīng)用于多種傳染性疾病的篩查工作中。然而,“花板"現(xiàn)象的出現(xiàn),往往會(huì)給實(shí)驗(yàn)者判讀結(jié)果帶來(lái)麻煩。所謂“花板",就是空白、陰性、陽(yáng)性對(duì)照及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常,而標(biāo)本孔的OD值卻偏高,弱陽(yáng)性結(jié)果較多。筆者對(duì)“花板"現(xiàn)象進(jìn)行了分析和總結(jié),認(rèn)為花板原因大多在樣品,解決辦法主要在洗滌,孵育和顯色過(guò)程也會(huì)導(dǎo)致。

  1、花板原因大多在樣品

  所謂“花板",就是空白、陰陽(yáng)性對(duì)照及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常,而標(biāo)本孔的OD值卻偏高。之所以空白、對(duì)照及質(zhì)控結(jié)果正常而標(biāo)本孔異常,是因?yàn)闃悠繁旧淼脑颍蟛糠只蛉繕?biāo)本孔的OD值偏高,很可能是因?yàn)闃悠分心承┕灿械奈镔|(zhì)非特異性的吸附于固相載體,而在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中未被除去。

  1.1、 待測(cè)血清中混有紅細(xì)胞或纖維蛋白原 這兩種物質(zhì)易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈,實(shí)驗(yàn)表明在較高的離心轉(zhuǎn)速(3000 /min)和較長(zhǎng)的離心時(shí)間(>10 min)之下,血液標(biāo)本被充分地離心分離之后,使紅細(xì)胞和纖維蛋白充分沉淀,可以在加樣時(shí)避免加入紅細(xì)胞和纖維蛋白,避免這兩種干擾物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,就可避免“花板"情況。

  

血清 試劑盒


  1.2、 高IgG血癥 在實(shí)際工作中,檢測(cè)丙肝的實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)花板的情況較多,原因之一是因?yàn)槟繃?guó)內(nèi)外的抗-HCV EIA試劑均采用間接酶聯(lián)免疫檢測(cè)原理,間接法的一個(gè)重要影響因素是血清中所含的高濃度的非特異性IgG,IgG對(duì)聚苯乙烯有較強(qiáng)的吸附力,非特異性IgG可吸附到固相載體上或包被的抗原上造成假陽(yáng)性。

  2、解決辦法主要在洗滌

  聚苯乙烯因其具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能而被廣泛用于ELISA實(shí)驗(yàn)的固相載體,聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,因此需要通過(guò)洗滌清除在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌在 ELISA 過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟,但卻決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。上述提到的血清中存在紅細(xì)胞或纖維蛋白原,可以在加樣離心時(shí)得到控制,同樣也可以通過(guò)適當(dāng)增加洗滌次數(shù)和浸泡時(shí)間減輕或避免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,同樣,對(duì)于血液存在的非特異性的IgG,實(shí)驗(yàn)者很難在加樣時(shí)將其去除,那么解決的時(shí)機(jī)就是洗滌過(guò)程。

  ELISA在洗滌過(guò)程中需注意以下幾點(diǎn):

  (1)、板要平整,尤其是在用洗板機(jī)洗板的過(guò)程中,往往是3排一起洗,如果板不平,就很可能造成洗液有殘留,從而導(dǎo)致非特異性結(jié)合不能清除干凈,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾。

  (2)、洗液溫度,實(shí)驗(yàn)表明,洗液溫度也會(huì)影響洗板的干凈程度,尤其是冬天溫度過(guò)低時(shí)容易出現(xiàn)“花板"問(wèn)題。因此,保持室溫在20℃-30℃。

  (3)、洗液要注滿孔,孔壁洗滌不干凈也易造成“花板"現(xiàn)象。

  (4)、洗液要新鮮配置,洗液要臨用新鮮配制,放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易產(chǎn)生絮狀物或混濁,造成賭孔或花板。

  (5)、洗板次數(shù)不夠或洗滌間隔時(shí)間過(guò)短也會(huì)造成由于洗板不凈而造成“花板"。

  3、孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)造成“花板"

  實(shí)驗(yàn)室有一段時(shí)間經(jīng)常出現(xiàn)丙肝檢測(cè)“花板"現(xiàn)象,究其原因是由于樣本較多,加樣后未及時(shí)放入孵育箱,反應(yīng)板在室溫呆的時(shí)間過(guò)長(zhǎng),即間接增加了孵育時(shí)間,導(dǎo)致孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng),蛋白質(zhì)非特異性吸附于固相載體。因此,應(yīng)嚴(yán)格控制加樣時(shí)間,加樣后及時(shí)孵育,標(biāo)本較多時(shí)可分批操作。

  此外,有些廠家的試劑顯色液不穩(wěn)定,使用容易變藍(lán),如在實(shí)驗(yàn)不仔細(xì)檢查,很容易導(dǎo)致“花板"現(xiàn)象的發(fā)生,這也提醒實(shí)驗(yàn)者應(yīng)使用新鮮的顯色液,程度的實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

  綜上所述,將ELISA“花板"現(xiàn)象總結(jié)為:花板原因大多在樣品,解決辦法主要在洗滌,孵育和顯色過(guò)程也會(huì)導(dǎo)致。既然原因大多在樣品,那么在樣品交接時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)定,無(wú)溶血,無(wú)凝血,足量,單個(gè)的溶血樣品雖不致造成“花板",但血紅蛋白中的血紅素基團(tuán),具有類(lèi)過(guò)氧化物的活性,在以辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)為標(biāo)記酶的ELISA測(cè)定中,易在孵育過(guò)程中吸附于固相,從而與后面加入的底物反應(yīng)顯色,從而造成假陽(yáng)性。洗滌是ELISA的關(guān)鍵步驟,充分有效的洗滌也是避免“花板"的有利措施。同樣,嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明孵育,使用新鮮的顯色液也是有效避免“花板"的保障。以上措施可以有效減少“花板"次數(shù),從而提高檢測(cè)的特異性和準(zhǔn)確性,更好的發(fā)揮ELISA的方法學(xué)優(yōu)勢(shì)。

  ELISA本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命,追求企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力的不斷提升。公司在經(jīng)營(yíng)中始終秉承:遵紀(jì)守法,嚴(yán)于律己,寬仁以待,敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn),以過(guò)硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來(lái)維護(hù)和拓展市場(chǎng),較大限度的滿足客戶(hù)的需求。與客戶(hù)的共贏,是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們?cè)概c您真誠(chéng)合作,共創(chuàng)美好的未來(lái)。

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